Utilização de PCR-multiplex para identificação de Staphylococcus aureus e avaliação da resistência à oxacilina e mupirocina / Multiplex PCR use for Staphylococcus aureus identification and oxacillin and mupirocin resistance evaluation

Oxacillin-resistant Staphylococcus aureus represents a serious problem in hospitals worldwide, increasing infected patients? mortality and morbidity and raising treatment costs and internment time. In this study, the results of using the Multiplex PCR technique to amplify fragments of the genes femA (specific-species), mecA (oxacillin resistance) and ileS-2 (mupirocin resistance) were compared with those of tests conventionally used to identify S. aureus isolates and ascertain their resistance to drugs. Fifty S. aureus strains were isolated from patients receiving treatment at UNOESTE University Hospital in Presidente Prudente, SP, Brazil. The 686 bp fragment corresponding to the gene femA was amplified and detected in all the isolates. On the other hand, the 310 bp fragment corresponding to the mecA gene was amplified in 29 (58%) of the isolates. All of the isolates showed sensitivity to mupirocin in the agar diffusion test, which was corroborated by the lack of any amplicon of the 456 bp fragment corresponding to the ileS-2 gene, in the PCR bands. The conventional tests to identify S. aureus and detect resistance to oxacillin and mupirocin showed 100% agreement with the PCR Multiplex results. The use of techniques for rapid and accurate identification of bacteria and assessment of their resistance may be valuable in the control of infection by resistant strains, allowing the rapid isolation and treatment of an infected patient. However, the results demonstrate that traditional phenotypic tests are also reliable, though they take more time.

Staphylococcus aureus resistente à oxacilina representa um problema grave em hospitais de todo o mundo, aumentando a morbidade e mortalidade de pacientes infectados e, elevando os custos do tratamento e tempo de internação. Neste trabalho, foram comparados os resultados da técnica de PCR Multiplex para amplificação dos fragmentos dos genes femA (espécie-específico), mecA (resistência à oxacilina) e ileS-2 (resistência à mupirocina) com os resultados da identificação e testes convencionais para avaliação da resistência. Cinqüenta S. aureus foram isolados de pacientes atendidos no Hospital Universitário "Dr. Domingos Leonardo Cerávolo" da Unoeste, em Presidente Prudente, SP, Brasil. Houve amplificação do fragmento 686 pb, correspondente ao gene femA para todos os isolados. Por outro lado, houve amplificação do fragmento 310 pb correspondente ao gene mecA em 29 (58%) dos isolados. Todos os isolados mostraram sensibilidade à mupirocina observados no teste da difusão em ágar, e também pela ausência de amplificação do fragmento 456 pb, correspondente ao gene ileS-2. Os resultados dos testes convencionais para identificação de S. aureus e avaliação de resistência à oxacilina e mupirocina mostrou 100% de concordância com os resultados da PCR Multiplex. A utilização de técnicas mais rápidas e precisas para identificação e avaliação de resistência pode ser valiosa para o controle de infecção por cepas resistentes, permitindo rápido isolamento e tratamento do paciente. Entretanto os resultados demonstram que testes fenotípicos tradicionais também são confiáveis, apesar do maior tempo de execução.

Determinação da resistência de Staphylococcus aureus: um desafio? / Identification of drug resistance in Staphylococcus aureus: a challenge?

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de resistência de cepas de Staphylococcus aureus, com diferentes padrões de eletroforese em campo pulsado (PFGE), em relação à resistência induzida à clindamicina e caracterizar cepas resistentes à oxacilina por testes fenotípicos. Do total de 18 cepas diferenciadas por PFGE, isoladas dos sítios nasais ou linguais de portadores adultos saudáveis, sem doença de base, sem histórico de uso de antibióticos e internações hospitalares, quatro (22,2%) apresentaram sensibilidade à clindamicina no antibiograma convencional, mas demonstraram resistência no D-teste; uma cepa (5,6%) foi caracterizada como BORSA (borderline) em relação à resistência a oxacilina e outra (5,6%) CA MRSA (S.aureus meticilina/oxacilina resistente associado à comunidade), ambas sensíveis à cefoxitina pelo teste de disco difusão. A caracterização molecular pela reação em cadeia para polimerase (PCR) da cepa identificada fenotipicamente como CA MRSA não revelou a presença do gene mecA, indicando tratar-se de cepa BORSA. Estes resultados apontam a importância do emprego rotineiro do D-teste como ferramenta para a determinação da resistência do tipo induzida à clindamicina, bem como para a importância da inclusão do teste de resistência à cefoxitina entre os métodos fenotípicos para caracterização de MRSA.

The aim of this study was to identify the resistance profile of Staphylococcus aureus strains, in relation to induced clindamycin resistance, and to detect oxacillin resistance by the routine phenotypic methods. The strains were isolated from nasal or lingual swabs taken from healthy adult carriers with no medical history of hospitalization or antibiotic treatment. Eighteen strains were distinguished by the different patterns generated by pulsed gel electrophoresis (PFGE). Four (22.2%) of these showed sensitivity to clindamycin by the conventional antibacterial susceptibility test, but demonstrated inducible resistance to it by the D-test. One strain (5.6%) was characterized as borderline oxacillin-resistant S. aureus (BORSA), and another (5.6%) as CA MRSA (community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Both of these strains were shown to be cefoxitin susceptible by the disk diffusion test. The polymerase chain reaction (PCR) failed to detect the mecA gene in this last strain and it was thus classified as BORSA. These results show the importance of incorporating the D-test into the routine lab tests for S. aureus inducible clindamycin resistance and also of including the cefoxitin resistance test among the phenotypic methods for MRSA characterization.

Aplicabilidade do TTC para a detecção de bacteriúria / Applicability of TTC test to bacteriuria detection

Exames laboratoriais para detecção da infecção urinária com custo menor que da urocultura têm sidobuscados. O cloridrato de trifeniltetrazólio foi avaliado em 342 amostras de urina paralelamente à urocultura objetivando a detecção de bacteriúria significativa. Os resultados demonstraram que o teste apresenta boa sensibilidade (91,3%) e baixa especificidade (64,3%), com valor preditivo negativo de 99,0%. Apesar do teste não substituir a urocultura como método diagnóstico, pode ser recomendado para a triagem de bacteriúria, eliminando a realização da cultura em amostras negativas.

Detecção da produção de slime por estafilococos coagulase-negativa isolados de cateter venoso central / Detection of slime production by coagulase-negative staphylococci isolated from central venous catheter

A produção de slime é um importante fator de virulência dos estafilococos coagulase-negativa, permitindo-lhes aderir sobre as superfícies lisas de biomateriais, e por isso, é associada aos processos de infecção de implantes. No presente estudo a produção de slime em 27 cepas de estafilococos coagulase-negativa foi investigada por cultura em ágar vermelho Congo (77,7% de positividade), método espectrofotométrico ou damicroplaca (81,4% de positividade) e microscopia eletrônica de varredura (88,9% de positividade). Foi também avaliada a resistência de estafilococos coagula-se negativa a vários antimicrobianos usando a técnica do disco difusão. A porcentagem de resistência à penicilina G, oxacilina, eritromicina, clindamicina e gentamicinaem estafilococos produtores de slime foi respectivamente de 88,9%; 70,4%; 81,5%; 66,7% e 59,2%; todos os estafilococos coagulase-negativa foram vancomicina sensíveis. As cepas isoladas de cateter venoso central foram identificadas por método convencional e sistema API Staph. Os 27 estafilococos coagulase-negativa foram identificados como: S. saprophyticus (3,7%), S. xylosus(7,4%), S. haemolyticus (14,8%), S. epidermidis (37,0%), S. warneri (14,8%), S. lugdunensis (7,4%), S. hominis (7,4%), S. schleiferi (3,7%) e S. chromogenes (3,7%). Pode-se concluir que entre a maioria das espécies Staphylococcus coagulase-negativa houve associação entre a produção de slime, origem nosocomial das cepase reduzida sensibilidade aos antimicrobianos, sugerindo potencial patogênico no ambiente hospitalar.

Slime production is an important virulence factor of coagulase-negative Staphylococcus spp., allowing them to attach to smooth surfaces of biomaterials, and it has been associated with infections of implanted medical devices. In the present study the production of slime capsules in 27 strains of coagulase-negative Staphylococcus was investigated by culture in Congo Red agar (77.7% positivity), spectrophotometric or microplate method (81.4% positivity) and scanning electron microscopy (88.9% positivity). The resistance of coagulase-negative strains of Staphylococcus to various antimicrobial agents was also determined by agar disk diffusion. The proportion of strains resistant to penicillin G, oxacillin, erythromycin, clindamycin and gentamicin among the slime-producing staphylococci was 88.9%, 70.4%, 81.5%, 66.7% and 59.2%, respectively; all of the coagulase-negative staphylococci were susceptible to vancomycin. The strains isolated from central venous catheters were identified by a conventional method and the API Staph system. The 27 coagulase-negative taphylococcus strains were identified as: S. saprophyticus (3.7%), S. xylosus (7.4%), S. haemolyticus (14.8%), S. epidermidis (37.0%), S. warneri (14.8%), S. lugdunensis (7.4%), S. hominis (7.4%), S. schleiferi (3.7%) and S. chromogenes (3.7%). It can be concluded that in the most of the coagulase-negative Staphylococcus species there was an association between slime production, the nosocomial origin of the strains and reduced sensitivity to the antibiotics, suggesting a pathogenic potential in the hospital environment.

Assessment of central venous catheter-associated infections using semi-quantitative or quantitative culture methods

Semiquantitative (Maki) and quantitative (Brun-Buisson) culture techniques were employed in the diagnosis of catheter-related bloodstream infections(CRBSI) in patients who have a short-term central venous catheter (inserted for 30 days). The diagnosis of CRBSI was based on the results of semiquantitative and quantitative culture of material from the removed catheters. Catheter tips (118) from 100 patients were evaluated by both methods. Semiquantitative analysis revealed 34 catheters (28.8%) colonized by greater or equal 15 colonyforming units (cfu), while quantitative cultures (34 catheters, 28.8%) showed the growth of greater or equal 103 cfu/mL. Bacteremia was confirmed in four patients by isolating microorganisms of identical species from both catheters and blood samples. Using the semiquantitative culture technique on short-term central venous catheter tips, we have shown that with a cut-off level of greater or equal 15 cfu, the technique had 100.0% sensitivity, specificity of 68.4%, 25.0% positive predictive value (PPV) and 100.0% negative predictive value (NPV), efficiency of 71.4% and a prevalence of 9.5%. The quantitative method, with a cut-off limit of greater or equal 103 cfu/mL, gave identical values: the sensitivity was 100.0%, specificity 68.4%, positive predictive value (PPV) 25.0%, negative predictive value(NPV) 100.0%, efficiency 71.4% and prevalence 9.5%. We concluded that the semiquantitative and quantitative culture methods, evaluated in parallel, for the first time in Brazil, have similar sensitivity and specificity.

Avaliação da formação do biofilme de Candida albicans sobre superfície de titânio revestida com hidroxiapatita por meio de microscopia eletrônica de varredura / Assessment of Candida albicans biofilm formation on commercially pure titanium hydroxyapatite coated surfaces by means of scanning electron microscope

Neste estudo, a formação de biofilme por Candida albicans na superfície de corpos-de-prova de titânio comercialmente puro (Ti-cp) revestidos com hidroxiapatita foi observada por meio de microscópio eletrônico de varredura. O biofilme foi formado após 45 dias de incubação do corpo-de-prova de Ti-cp revestido, em meio de cultura líquido inoculado com as células leveduriformes, contido em tubo de poliestireno com tampa de rosca e esterilização. Após a remoção do biofilme com solução de EDTA 10%, pontos de corrosão foram observados na superfície rugosa/porosa do Ti-cp revestido com hidroxiapatita

Aderência e formação do biofilme por Staphylococcus aureus ao polietilenotereftalato (PET) usado como embalagem para acondicionamento de medicamentos e cosméticos / Staphylococcus aureus attachment and biofilm formation on polyethylene terephthalate (PET) used for packaging drugs and cosmetics

O polietilenotereftalato (PET) é utilizado como matéria prima para elaborar frascos, os quais podem ser empregados no acondicionamento de medicamentos e cosméticos. Esta pesquisa teve por objetivo examinar por microscópio eletrônico de varredura a aderência e formação do biofilme por Staphylococcus aureus sobre a superfície do polietilenotereftalato (PET) e pelo método de aderência ao hidrocarboneto determinar a hidrofobicidade do S. aureus. Uma suspensão de S. aureus foi inoculada em caldo Mueller-Hinton e os corpos-de-prova de polietilenotereftalato foram inoculados por 30 minutos, duas, 24 e 48 horas, 15 e 30 dias. O meio de cultura foi trocado a cada três dias. Após os períodos de incubação, os corpos-de-prova foram preparados para MEV. A aderência e formação do biofilme foi observada sobre as superfícies do PET. Os resultados da análise por MEV, mostraram que as superfícies do PET permitiram a aderência de S. aureus com a formação do biofilme. O teste de hidrofobicidade mostrou que o S. aureus tem características hidrofóbicas

Identificação de Enterobacter spp. através de técnicas convencionais e do sistema semi-automatizado Microscan (Autoscan-4) / Identification of Enterobacter spp. by conventional techniques and automated system Microscan (Autoscan-4)

Cento e noventa e cinco (195) cepas de enterobacter spp., isoladas de diversos materiais clínicos - urina, fezes, ponta de cateter, hemocultura, aspirado traqueal, fluido vaginal, ferida - foram submetidas à identificação através de provas bioquímico-fisiológicas clássicas e também, através de painéis NegCombo 20 do sistema semi-automatizado Micro-Scan-autoScan-4 (Dade Behring Inc., West Sacramento, CA, USA). As amostras eram provenientes de pacientes atendidos no Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia e Bioquímica da UNOESTE, Presidente Prudente, SP e de pacientes internados no Hospital Universitário Domingos Leonardo Cerávolo, pretencente à mesma Instituição. Do total de cepas testadas, 191 (97,9%) apresentaram identificação considerada concordante entre os dois métodos utilizados; 4 cepas (2,1%) apresentaram identificação discordante, ou seja, o gênero foi diferente em cada método. Através deste estudo concluiu-se que ambos os métodos utilizados para a identificação de Enterobacter spp. apresentam vantagens e desvantagnes relacionadas ao custo, facilidade de execução, rapidez, confiabilidade entre outras características. Além disso, nossos resultados mostram que a identificação de Enterobacter spp. pode ser realizada por métodos convencionais, sem prejuízo da confiabilidade

An infection control protocol: effectiveness of immersion solutions to reduce the microbial growth on dental prostheses.

This investigation evaluated the effectiveness of an infection control protocol for cleansing and disinfecting removable dental prostheses. Sixty-four dentures were rubbed with sterile cotton swab immediately after they had been taken from patients' mouths. Samples were individually placed in the culture medium and immediately incubated at 37 +/- 2 degrees C. The dentures were scrubbed for 1 min with 4% chlorhexidine, rinsed for 1 min in sterile water and placed for 10 min in one of the following immersion solutions: 4% chlorhexidine gluconate, 1% sodium hypochlorite, Biocide (iodophors) and Amosan (alkaline peroxide). After the disinfection procedures, the dentures were immersed in sterile water for 3 min, reswabbed and the samples were incubated. All samples obtained in the initial culture were contaminated with micro-organisms. All the lower dentures immersed in Biocide showed positive growth, and the upper dentures were positive for growth in six of eight dentures. The 4% chlorhexidine gluconate, 1% sodium hypochlorite and Amosan solutions have been proved effective to reduce the growth of the micro-organisms in the 10 min immersion period. The protocol evaluated in this study seems to be a viable method to prevent cross-contamination between dental personnel and patients.

Padrão de sensibilidade aos antimicrobianos de bacilos gram-negativos não fermentadores isolados de materiais clínicos de pacientes em Presidente Prudente - SP / Susceptibility pattern to the antimicrobial agents of nonfermenting Gram-negative bacilli isolated from clinical materials of patients at Presidente Prudente - SP

O objetivo do presente trabalho foi verificar a freqüência de isolamento e o padrão de sensibilidade aos antimicrobianos das espécies de bacilos Gram-negativos não fermentadores. Foram analisadas 98 cepas de bacilos Gram-negativos não fermentadores, isolados de diversos materiais clínicos de pacientes do Hospital Universitário Dr. Domingos Leonardo Cerávolo e Hospital Estadual Dr. Odilo Antunes Siqueira, bem como de pacientes ambulatoriais, todos atendidos no Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia e Bioquímica da Unoeste, Presidente Prudente, SP, no período de outubro de 1999 a abril de 2001. As espécies mais freqüêntes foram Pseudomonas aeruginosa (65,3 por cento), Acinetobacter baumannii (23,5 por cento). Para as outras espécies isoladas, as freqüências foram menores que 2,5 por cento. Nos testes de sensibilidade aos antimicrobianos, as duas espécies mais prevalentes mostraram alta resistência. O antimicrobiano mais ativo foi o imipenem, com 79,6 por cento (método de microdiluição), 76,6 por cento (método de difusão), das cepas de P. aeruginosa e 100 por cento das cepas de A. baumannii sensíveis, em ambos os métodos. As cefalosporinas de terceira geração, a ciprofloxacina e os aminoglicosídeos, apresentaram percentuais de sensibilidade variando entre 22,4 a 69,7 por cento. Esses resultados trazem implicações relativas ao uso emergencial dos antimicrobianos no tratamento de pacientes em infecção grave.

An infection control protocol: effectiveness of immersion solutions to reduce the microbial growth on dental prostheses / Um protocolo de controle de infecção: efetividade das soluções de imersão para reduzir o crescimento microbiano em prótese dentária

This investigation evaluated the effectiveness of an infection control protocol for cleansing and disinfecting removable dental prostheses. Sixty-four dentures were rubbed with sterile cotton swab immediately after they had been taken from patients` mouths. Samples were individually placed in the culture medium and immediately incubated at 37 ± 2ºC. The dentures were scrubbed for 1 min with 4 percent chlorhexidine, rinsed for 1 min in sterile water and placed for 10 min in one of the following immersion solutions: 4 percent chlorhexidine gluconate, 1 percent sodium hypochlorite, Biocide (iodophors) and Amosan (alkaline peroxide). After the disinfection procedures, the dentures were immersed in sterile water for 3 min, reswabbed and the samples were incubated. All samples obtained in the initial culture were contaminated with micro-organisms. All the lower dentures immersed in Biocide showed positive growth, and the upper dentures were positive for growth in six of eight dentures. The 4 percent chlorhexidine gluconate, 1 percent sodium hypochlorite and Amosan solutions have been proved effective to reduce the growth of the micro-organisms in the 10 min immersion period. The protocol evaluated in this study seems to be a viable method to prevent cross-contamination between dental personnel and patients